TP lycée "Test OGM" en images

Séparation des produits de PCR par électrophorèse
Analyse du gel

2ème séance

Les produits de PCR sont analysés par électrophorèse en gel d'agarose, un marqueur de taille (MT) permettant d'évaluer la taille des fragments repérables après coloration, sur l'électrophorégramme.
Les gels sont préparés par les élèves avec de l'agarose à 3% dans le tampon TAE.
Dépôts des échantillons dans les puits du gel
Les échantillons à déposer (produits de PCR et marqueur de taille) sont densifiés avec le tampon de charge Orange G . Les dépôts (20 µl) sont réalisés dans les puits du gel immergé dans le tampon TAE.
Piste
Echantillon déposé / solution d'amplification utilisée
Taille (pb) des fragments d'ADN recherchés
1
aliment non OGM / SAP (PSII, plante)
455
2
aliment à tester / SAO (OGM)
aucun / 203, 225 (confondus)
3
aliment non OGM / SAP (PSII, plante)
455
4
aliment à tester / SAO (OGM)
aucun
5
ADN OGM / SAP (PSII, plante)
455
6
ADN OGM / SAO (OGM)
203, 225 (confondus)
7
marqueur de taille
100, 200, 500, 700, 1000
Séparation par électrophorèse des fragments d'ADN précédemment amplifiés
Tension appliquée :100V, durée 30 min.
Les fragments d'ADN chargés négativement (groupements phosphate) migrent vres l'anode mais ils ne sont pas repérables. L'orange G se déplace comme un fragment de 50 pb environ. Sur l'image (migration en cours), on voit également les bandes rouges qui correspondent au colorant présent dans SAO.
Coloration du gel, révélation des bandes
Le gel est immergé dans le colorant Blast Fast qui permet soit une coloration rapide à concentration 100X, soit une coloration lente plus durable à concentration 1X. Les molécules de colorant (famille des thiazines) chargées positivement se fixent sur les groupements phosphates de l'ADN et colorent les fragments en bleu alors que l'agarose ne les retient que mécaniquement et on peut le décolorer avec de l'eau pour éclaircir le gel.
L'image illustre la coloration rapide qui permet l'analyse du gel à la fin de la séance de TP. Un gel est plongé dans le bain de colorant, l'autre déjà coloré est en phase de décoloration, dans l'eau.
Analyse d'un électrophorégramme
Chaque bande colorée indique la présence d'un grand nombre de fragments d'ADN qui ont migré à la même vitesse donc de même taille.
L'électrophorèse en gel d'agarose (même à 3%) ne permet pas de résoudre les bandes correspondant aux fragments de 205 pb et à ceux de 225 pb (discrimination insuffisante) qui apparaissent donc confondues.
La bande 455 pb est bien présente pour l'aliment témoin non OGM, pour l'aliment à tester (ici papaye fraîche) et pour l'ADN OGM. L'ADN végétal a été correctement extrait des 2 aliments et l'amplification s'est bien déroulée.
La bande 200 pb est bien nette pour l'ADN OGM et absente pour l'aliment à tester qui peut donc être considéré comme non OGM.