TP lycée "Test OGM" en images

Extraction de l'ADN, amplification par PCR de séquences ciblées

1ère séance

Extraction de l'ADN
L'ADN est extrait de l'aliment référence (non OGM) et de l'aliment à tester.

Un petit volume du broyat est mis en présence de microbilles (matrice Instagène) qui fixent les cations, en particulier Mg2+ ce qui a pour effet d'inhiber les ADNases. Le mélange doit être bien homogène (vortex).
Broyage de l'aliment dans l'eau
Chauffage
Préparation des tubes pour la PCR
L'ADN extrait de chaque aliment est mis en présence de la solution d'amplification qui contient la Taq polymérase, les 4 nucléotides triphosphates, Mg2+ et le ou les couples d'amorces nécessaires pour baliser respectivement le marqueur du gène qui code la protèine du PSII et ceux (promoteur et terminateur) du transgène.
Il faut éviter d'entraîner les billes de la matrice Instagène lors du prélèvement des échantillons d'ADN alimentaire car les ions Mg2+ sont nécessaires pour l'action de l'ADN polymérase.
Deux microtubes pour PCR sont également préparés avec l'ADN OGM positif.
Pour faciliter la reconnaissance des tubes, la solution d'amplification préparée pour les marqueurs du transgène (SAO) est rouge alors que celle qui permet d'amplifier le marqueur de l'ADN végétal (SAP) est colorée en vert.
20 µl de l'échantillon d'ADN extrait de l'aliment à tester ajoutés à 20 µl de la solution d'amplification SAO.
20 µl de l'échantillon d'ADN extrait de l'aliment à tester ajoutés à 20 µl de la solution d'amplification SAP.
Mise en place des microtubes dans le thermocycleur
tube
Echantillon
1
 ADN aliment non OGM + SAP avec 1 couple d'amorces pour gène PSII (plante)
2
 ADN aliment non OGM + SAO avec 2 couples d'amorces pour marqueurs du transgène (OGM)
3
 ADN aliment à tester + SAP avec 1couple d'amorces pour gène PSII (plante)
4
 ADN aliment à tester + SAO avec 2 couples d'amorces pour marqueurs du transgène (OGM)
5
 ADN témoin OGM positif + SAP avec 1 couple d'amorces pour gène PSII (plante)
6
 ADN témoin OGM positif + SAO avec 2 couples d'amorces pour marqueurs du transgène (OGM)
Amplification des séquences ciblées d'ADN par PCR

Principe de la PCR : voir animation site SVT Lycée
Le thermocycleur est programmé pour l'exécution de 40 cycles du programme suivant:
- dénaturation à 94°C, 1min
- hybridation à 59°C, 1min
- élongation à 72°C, 2min.

Le déroulement du programme peut être suivi sur l'écran de la machine. L'image indique un cycle en phase d'élongation (1min16).

A l'issue de l'amplification, les produits de PCR sont placés au congélateur dans l'attente de la séance suivante.