Immunoprécipitation (ring test)

Anatoxine tétanique (vaccin) / Immunoglobulines anti-tétaniques (sérum)

Il s'agit ici de proposer un exemple d'immunoprécipitation en milieu liquide pour matérialiser la formation d'immuns complexes Ag / Ac avec un support différent de ceux qui sont habituellement proposés aux élèves en TP de TS.
Le document présenté peut fournir quelques pistes pour construire une évaluation. Les notions suivantes sont considérées comme acquises : immunité innée / immunité adaptative, immunité à médiation humorale, vaccin / sérum, complexe Ag / Ac.
Le vaccin contient l'anatoxine tétanique
Le vaccin Revaxis utilisé ici est combiné, on peut le remplacer par le vaccin tétanique Pasteur qui ne contient, comme antigène, que l'anatoxine tétanique. Dans les 2 vaccins, c'est une culture de Chlostridium tetani qui fournit la toxine. Elle est isolée du milieu puis purifiée. Elle est ensuite détoxifiée par le formaldéhyde et la chaleur (39°C). Ce traitement permet d'obtenir l'anatoxine qui a perdu sa toxicité tout en conservant ses propriétés antigéniques. Pour être vraiment efficace, l'anatoxine est adsorbée (interactions surtout électrostatiques) sur un support minéral, l'hydroxyde d'aluminium Al(O)OH, qui se présente sous la forme de nano-cristaux, assemblés en agrégats (environ 10 µm).
L'hydroxyde d'aluminium est un adjuvant dont le mécanisme d'action n'est pas complètement élucidé. Il participe activement au déclenchement d'une réponse immunitaire innée avec réaction inflammatoire. Sa présence facilite l'intervention des phagocytes, ralentit la diffusion de l'anatoxine (Ag), ce qui allonge la période d'afflux des cellules inflammatoires au site d'injection. L'adjuvant induit notamment le recrutement sur place de cellules dendritiques qui internalisent les agrégats et exhibent des motifs antigéniques de l'anatoxine associés au CMH. Ensuite ces cellules dendritiques migrent vers les organes lymphoïdes secondaires où elles vont participer à l'initiation d'une réponse immunitaire adaptative, spécifique. Elles changent alors de fonction et se comportent comme des cellules présentatrices d'antigènes capables d'activer des LT CD4 sélectionnés indispensables au développement d'une réponse immunitaire impliquant des LB (eux-même sélectionnés par les Ag) et orientée vers la production d'anticorps. L'intervention de l'adjuvant est indispensable pour déclencher la réponse innée qui prépare la réponse adaptative à médiation humorale.

Le sérum contient des immunoglobulines anti-tétaniques
La sérothérapie antitétanique (immunité passive) est basée sur l'injection de gammaglobulines capables de neutraliser la toxine tétanique. On utilise le plus souvent les IgG polyclonales humaines (exemple: GAMMATETANOS) qui sont préparées à partir du plasma de donneurs immunisés par l'anatoxine tétanique (vaccination). On a plus rarement (risques d'allergie plus importants) recours à des IgG tétaniques équines extraites du plasma de chevaux hyperimmunisés contre la toxine tétanique, IgG dont on ne conserve (action de la pepsine) que les fragments F(ab')2 . Un extrait de la notice de chacun des "sérums" est fourni ci-dessous.

La présence d'Ig dans la solution injectable (à Ig équines) peut être matérialisée par la réalisation d'une électrophorèse menée parallèlement à celle d'un sérum total de lapin non immunisé (référence) mais aussi à celle d'un sérum total de lapin immunisé (ici contre la Sérum Albumine Bovine) et à celle de la fraction Ig d'un sérum de lapin immunisé (produit Sigma). Voir, ci-dessous, un électrophorégramme obtenu en TP.
Pour le test d'immunoprécipitation, on peut utiliser soit les Ig humaines, soit les Ig équines.

- Pistes 1 et 7 : sérum de lapin non immunisé
- Pistes 2 et 8 : sérum de lapin immunisé
- Pistes 3 et 9 : fraction Ig d'un sérum de lapin immunisé
- Pistes 4 et 6 : sérum Pasteur antitétanique
- Piste 5 : essai avec vaccin antitétanique Pasteur
Les protéines présentes dans le sérum antitétanique migrent bien comme la fraction g globulines dans laquelle on retrouve les Ac du sérum de lapin immunisé. La bande obtenue est étalée car il s'agit d'Ig polyclonales. L'anatoxine présente dans le vaccin ne migre pas car elle est adsorbée.

Le test de l'anneau : immunoprécipitation anatoxine tétanique (vaccin) / Ig antitétaniques (sérum)
On fait rencontrer, dans une pipette Pasteur, les molécules d'anatoxine tétanique (ici vaccin Revaxis) et celles des IgG du sérum (ici GAMMATETANOS). Un petit volume de sérum est placé dans la pipette puis le vaccin est introduit goutte à goutte.
Un précipité en anneau, localisé dans une zone précise, apparaît. Voir image à droite.
Ce précipité matérialise la formation de complexes anatoxine (Ag) / Ac. anti-anatoxine.
Pour rendre compte de la précipitation, il faut considérer que l'anatoxine se comporte comme un Ag multi-épitopique (multivalent) qui se lie à différents Ac (les Ig sont polyclonales) ce qui conduit à la formation de réseaux tridimensionnels.Ces réseaux s'assemblent pour former des agrégats visibles dans la zone d'équivalence dans laquelle le rapport moléculaire Ag / Ac a une valeur précise.
Rq/ La présence des complexes hydroxyde d'aluminium / anatoxine rend peut être le précipité plus net.

On peut demander aux élèves de représenter la structure moléculaire (2D) du complexe immun obtenu ici en négligeant l'adjuvant présent dans le vaccin.

Test de l'anneau : immunoprécipitation anatoxine tétanique / Ig antitétaniques
Immun précipité observé au microscope
Coloration : bleu de Coomassie